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SEM特殊样品的制备技术
文章来源:互联网转载      发布者:网络
一、直接观察法
 
1.基本描述:样品不经过任何处理,直接粘贴到样品托上入镜观察
 
2.适用范围:适合于低倍条件下, 观察含水量少的、表面有一定导电能力的、对分辨率要求不高的样品.
 
3.基本步骤:取材→风洗水洗后风干或不洗→粘样→常压或低压观察
 
4.适用样品: 植物干标本,干种籽,干果、果壳,竹木、骨骼、牙齿、蛋壳、土壤、岩石、金属等
 
 
 
二、活体观察法
 
1. 基本描述:
 
利用样品本身具有的导电和产生二次电子的能力,直接观察一些体积较小、含水分不多的活体昆虫或新鲜组织、器官的方法。其特点是:可观察生物活体形态结构和生活状态,图像表现真实,没有变形或人为附加结构。
 
2. 基本要求:
 
⑴ 限制昆虫的爬行和跳跃,用胶带限制其活动。
 
⑵ 样品体积尽可能小;
 
⑶ 低压观察常用2-5Kv,最大10Kv;
 
⑷ 操作熟练,迅速观察尽早摄影
 
3. 基本步骤:
取材→清洗或不洗→胶带粘样→常压或低压观察
 
4. 适用样品:
 
螟、蛾、蚊、蚁、蜂、螨、线虫、被粘牢固的昆虫或其器官
 
 
 
三、粘贴镀膜观察法
 
1. 基本描述:
 
样品只进行粘贴、镀膜即可。
 
其特点:常压观察下获得高分辨率高放大倍数图像。
 
2. 适用范围:
 
适宜 观察表面细微结构丰富、含水量少的、形态比较固定或不宜进行脱水或干燥的样品。本方法解决了样品的导电率及二次电子发射量的问题,可以常压下观察高倍率、高分辨率图像
 
3. 基本步骤:
 
取材→粘样→镀碳(样品表面凹凸变化大的可先喷镀碳层)→金属膜 →常压观察
 
4. 适用样品:
 
成熟的孢子、花粉,生活状态的菌体、菌落,尘埃、微小颗粒,丝绒、毛发,表面凹凸变化大的样品,如昆虫体表等。
 
 
 
四、熏蒸固定观察法
 
1. 基本描述:
 
粘贴后的样品放置于密闭容器中,用熏蒸法进行固定,经镀膜或不镀膜即可观察。其特点:该方法适合“不宜在液体中处理样品”,蒸汽固定剂为1%-2%的锇酸,全部操作在通风橱进行,高倍观察时还应离子溅射镀膜。
 
2. 基本步骤:
 
取材→粘样→熏蒸固定(10-30min)→镀膜或不镀膜→常压或低压观察
 
3. 适用样品: 固定培养基上的培养物,用于研究培养细胞的生长繁殖过程,菌落的自然状态、菌丝的生长,孢子的形成等。
 
 
 
五、石蜡组织切片观察法
 
1. 基本描述:
 
对动植物的石蜡切片进行适当处理,放在SEM下观察。其特点:图像分辨率高、景深大立体感强,制样简单、成本低、时间短。
 
2. 基本步骤:
 
光镜定位→切片→贴台→脱蜡(二甲苯,3-5min后滤纸吸附溶解物,反复3-5次)→镀膜(或不镀膜)→观察
 
3. 适用样品:
 
一切组织的石蜡切片都适用,但对已经封固或加盖片的不能用。
 
 
 
六、样品的割断
 
(一) 树脂割断法
 
1. 环氧树脂冷冻割断法:
 
取材修样(1*1*5mm) →固定脱水→包埋置换→固化→割断样品→脱树脂→临界点干燥→装台粘胶
 
2. 苯乙烯树脂割断法
⑴ 特点:
 
a.包埋的树脂已聚合,可长期保存
 
b.割断时在室温下进行
 
c.易割断较硬的组织(骨骼,结缔组织)
 
⑵ 步骤:
 
取材固定脱水→置换→包埋→聚合→割断→脱树脂→醋酸异戊酯置换→临界点干燥→装台粘胶
 
(二) 有机溶媒割断法
 
1. 无水乙醇冷冻割断法:
 
优点:制作时间短,不易弄脏容器
 
步骤:取材固定脱水→100%乙醇包埋→冰冻固化→冷冻裂断→融化乙醇→临界点干燥→装台粘胶
 
2. 70%乙醇冷冻干燥
 
特点:经济简单,但不能人为确定断裂面
 
步骤:准备→冷冻→自然断裂→冷冻干燥→装台→喷金
 
(三) 干燥样品的割断
 
方法:
 
(1)刀切
 
(2)镊子掰开
 
(3)双面胶带法
 
(4)液氮冷冻割断
 
 
 
七、蚀刻法
 
1. 酶蚀刻法
 
利用酶的作用使细胞的一部分物质被蚀刻去掉, 从而清楚的显示出另外一部分结构。
 
如:利用链霉蛋白酶(prorase)处理小麦的胚乳细胞,把包在外面的细胞去掉,以观察淀粉的结构。
 
2.离子蚀刻法
 
使用离子溅射仪进行辉光放电时,用高速的阳离子冲击样品表面,剥离掉样品的成分,暴露样品内部细微结构。
 
如:用该方法可以看到白细胞、胰脏外分泌细胞的核表面结构,清楚看到核孔的分布状况。
 
 
 
八、铸型技术
 
1. 概念:
 
为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布,先向腔内注射某种成形物质,待该物硬化后再把组织腐蚀去掉,剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布,这种技术称铸型技术。
 
2. 常用的铸型剂:
 
甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂,为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物,是理想的铸型剂。
 
3. 用ABS制作血管铸型样品的一般步骤
 
⑴ 灌流和注入铸型剂
 
⑵ 腐蚀和清洗
 
⑶ 显微解剖和剥制铸型
 
⑷ 干燥和镀膜
 
 
 
九、环氧树脂包埋的样品SEM观察法
 
1. 基本描述:
 
环氧树脂包埋的样品切成半薄切片或超薄切片后,再将环氧树脂除去,在SEM下观察研究,可以对样品的细胞结构进行多种综合研究,得到更多的信息。
 
2.常用溶剂:
 
氢氧化钠饱和乙醇(或醚类、丙酮)容易可以溶解已经聚合的环氧树脂,将NaOH溶解于乙醇,饱和(2%-4%),放置2-3天,在此过程中产生氧自由基,溶液颜色由浅褐色变成金棕色,氧自由基可以打断环氧树脂和酸酐间的酯连接,溶解环氧树脂。也可用NaOH的冠醚溶液。
 
3.操作步骤:
 
⑴ 解剖镜下除去环氧树脂中不感兴趣的部分。
 
⑵ 将组织块(或切片)放入合适的容器中,其中加入溶解液NaOH的乙醇溶液5-10ml,1-4h
 
⑶ 样品取出放入绝对乙醇(或冠醚)中彻底清洗组织
 
⑷ 临界点干燥
 
⑸ 粘胶镀金属膜并观察。
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